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Flash和Prep液相色譜
上樣量選擇的理論基礎
Pure應用
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簡介
在制備液相色譜中，樣品的上樣量是影響分離效果的重要因素之一。要純化分離的樣品應以合適的濃度添加到色譜柱柱床上，以實現(xiàn)窄的水平譜帶。如果上樣量太大，則譜帶變寬，分離效率降低。
Flash和Prep HPLC的上樣量有很大不同。由于Flash色譜通常用于預純化，高分辨率不是優(yōu)先考慮的因素，因此上樣量往往比Prep HPLC高。在Prep HPLC中，主要目的是獲得最高純度的物質，故基線必須得到分離。
正相和反相二氧化硅（如C-18、氨基或二醇基）的上樣量也存在相當大的差異。由于非鍵合相二氧化硅的表面積大，故這種固定相的載樣能力更高。正相二氧化硅的載樣能力通常比鍵合二氧化硅的載樣量高約10倍。
標準二氧化硅（粒徑40-60 μm）通常可接受10%的載樣量；在使用較小顆粒（15-30μm）時可以達到30%。然而，重要的一點我們要知道，無論是反相還是正相，上樣量由樣品的復雜程度決定的。對于含有多種化合物的復雜樣品，決定其復雜性的因素是純化目標化合物與其鄰近的洗脫組分的分離程度。通常情況下，復雜樣品需要少量多次的上樣方式來處理。
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制備液相色譜上樣量選擇的理論基礎
在液相色譜中，樣品可以通過兩種不同的方式上樣：固體或液體。液體上樣，是將樣品溶解在溶劑中后，直接注入色譜柱上。固體上樣，是將粗樣品與載體材料（如硅膠）的固體均勻混合物放在色譜柱前面。
▲ 圖1：液體和固體樣品
每種技術都有其需要考慮的特殊方面，下面將進行更詳細的討論。
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液體上樣
液體上樣是一種將樣品很好地溶解在洗脫初始溶劑中的方法，可用于 Flash 和 Prep 液相色譜應用中。推薦使用弱極性溶劑，因為強極性溶劑會降低分離度。
液體上樣被認為是最簡單、最快捷的方法，但可能會造成樣品損失，需要考慮的因素如下：
化合物在初始溶劑中的溶解度:樣品需要完全溶解，因為進樣系統(tǒng)或色譜柱頂部的沉淀可能在系統(tǒng)中產(chǎn)生過大的壓力，并最終導致樣品流失。
溶解溶劑的極性：如果使用極性溶劑溶解樣品，則它們可能會吸附在極性硅膠柱基質上，并對更多極性化合物（后來在硅膠材料上洗脫的化合物）的分離產(chǎn)生不利影響。
樣品溶劑的體積:體積越大，樣品從一開始就遷移到填料柱床中的風險就越高，從而導致譜帶變寬、分離度降低。理想的樣品體積不應超過色譜柱體積的10%。樣品的保留率越高，可裝載的體積就越大。
樣品量：每根色譜柱都有規(guī)定的裝載量。理想的樣品量不應超過純化柱的最大裝載量。
在 Flash 液相色譜中，通常是在注射器的幫助下將液體樣品手動直接注入到色譜柱頂部（如下圖）。由于高背壓，無法在 Prep 液相色譜柱上進行手動上樣。
因此，它是通過專用的進樣閥完成的，如圖所示：
▲ 圖2：Flash和Prep HPLC中的液體上樣
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固體上樣
固體上樣是僅適用于 Flash 色譜分離應用的技術，用于只能在強溶劑中溶解的樣品，或用于具有難以溶解的粘性或多雜質樣品。該方法可以通過減少譜帶展寬和隨后的拖尾效應來改善分辨率。一般來講，固體上樣分離較慢，但與液體上樣相比，分辨率更高。推薦的樣品量不應超過色譜柱的最大載樣量。
固體上樣通常通過以下步驟完成：
將粗樣品溶解在合適的極性溶劑中。
然后，將該混合物在超聲浴中超聲幾分鐘，以提高溶解度。
過濾混合物以除去尚未完全溶解的物質。
將硅膠以粗樣品重量的5倍添加到上述混合物中。
溶劑通過旋轉蒸發(fā)儀完全地減壓蒸餾干。
最后，將粗樣品和硅膠的混合物裝入固體裝樣器中，然后將其安裝在色譜柱的前面。連接溶劑洗脫流路。
待分離的組分不斷地從固體裝樣器中洗脫到實際分離色譜柱中。
▲ 圖3：在Flash色譜分離中的固體上樣
支撐材料在固體上樣技術中起到至關重要的作用：吸收粗樣品，使洗脫的化合物能更好地轉移和分配。它還可以將樣品固定在適當?shù)奈恢谩＿@對于具有挑戰(zhàn)性的樣品（如油性提取物）非常有利。
非鍵合的二氧化硅是最常用的吸附劑，但可能不是最佳的選擇。通常，建議使用與色譜柱相同類型的硅膠作為支撐材料。這樣可以避免不必要的化學相互作用或樣品的不可逆吸附。一種有用的替代材料是 Celithe,由于其中性的化學特性，它不與任何物質發(fā)生相互作用。
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結論
綜上所述，液體上樣和固體上樣各有優(yōu)劣、各有所長，可根據(jù)樣品性質和試驗目的來選擇使用，差異化的操作來得到目標純化合物。
表1：固體上樣和液體上樣的差異
技術 | 優(yōu)勢 | 劣勢 |
液體上樣 | 快速、簡單 | 分辨率較差 |
固體上樣 | 高分辨率 | 耗時 |
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