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引言

在細胞外囊泡（EVs）下游工藝的顆粒定量監測方面，行業長期面臨諸多挑戰。這些挑戰往往源于剪切力對顆粒穩定性的破壞、配方工藝尚未優化，以及復雜培養基中聚集體的干擾。

本文采用Phoenestra的無血清、無 hPL 的培養體系，結合溫和的純化工藝，有效規避了這些干擾因素，可以實現 EV 顆粒質量的精準平衡評估，并計算來源于間充質基質細胞（MSC）的 EV 工藝產率；然后再借助Particle Metrix的納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView與 F-NTA 四跨膜蛋白檢測試劑盒，可以成功實現在下游工藝過程中對四跨膜蛋白陽性顆粒的靈敏檢測與動態追蹤。

這一技術組合不僅提升了EV檢測的準確性和特異性，更顯著提高了整個生產流程的可控性與標準化水平。

實驗方法

MSC/TERT 細胞培養的上清液通過 EVscale? 技術以灌流模式持續收集。收集到的溶液保存在 -80°C 條件下。

步：處理時，先進行一次溫和的深層過濾（截留孔徑為 2–4 μm）。為提高回收率，再使用緩沖液對濾膜進行沖洗，最終獲得濃縮倍數（CF）為 0.8 的產物。

第二步：借用低剪切力的膜泵和截留分子量為 300 kDa 的中空纖維膜組件，進行切向流過濾（TFF）純化。在此步驟中，樣品溶液被濃縮，并通過六個透析體積的緩沖液進行溶液替換。最終，緩沖液更換率達到 98%以上，濃縮倍數為 3–4。

第三步：為進一步提高顆粒濃度，再對樣品進行超濾離心處理（截留分子量100 kDa），超濾后的濃縮倍數約為 50。

第四步：再通過離心的方法去除純化過程中形成的聚集體和沉淀物，把樣品等量分裝。

在以上每一個純化步驟前、后均采集樣品，并通過納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView（Particle Metrix）進行檢測。其中，散射光模式（NTA）用于測定總顆粒數，而結合了四跨膜蛋白檢測試劑盒的熒光模式（F-NTA），用于定量測定表達了CD9、CD63 和 CD81 的細胞外囊泡。

圖3：四跨膜蛋白陽性顆粒（F-NTA）在總顆粒（NTA）中的比例：展示了在下游純化工藝過程中，四跨膜蛋白陽性顆粒（即 EV）在總顆粒中的占比逐步上升的過程，這也說明了非 EV 顆粒在該純化工藝中已被有效去除。

總結

? 在本文中，使用無血清和無 hPL 的培養基，結合溫和的純化工藝，納米顆粒跟蹤分析儀ZetaView（NTA）可作為可靠的顆粒質量平衡分析工具。

? 借助四跨膜蛋白檢測試劑盒進行NTA技術的熒光標記檢測（F-NTA），可以有效驗證 EV 富集方法的特異性，確保所獲得的顆粒確實為EV顆粒。