鉆石會(huì)員
已認(rèn)證
關(guān)鍵詞：靜態(tài)流動(dòng)模式、單克隆抗體IgG、分子量分布
BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式適用于與凝膠滲透色譜GPC/SEC連接使用，其中GPC設(shè)備可以配置一個(gè)示差折光檢測(cè)器或者一個(gè)紫外檢測(cè)器，可以依賴(lài)于樣品組分的大小將每個(gè)組分分離，并依次流出。
BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式在90°使用PD檢測(cè)器收集樣品散射光強(qiáng)度信號(hào)，并同時(shí)收集示差折光檢測(cè)器或者紫外檢測(cè)器信號(hào)，結(jié)合這兩個(gè)信號(hào)計(jì)算得到每個(gè)流出組分的絕對(duì)分子量和分子量分布信息。由于BeNano采用的是單角度靜態(tài)光散射，根據(jù)瑞利散射理論只要分子大小不超過(guò)波長(zhǎng)1/40，結(jié)果的準(zhǔn)確性都能夠得到保證，這尤其適合對(duì)于蛋白質(zhì)類(lèi)樣品的檢測(cè)。
在這個(gè)應(yīng)用中，我們將BeNano主機(jī)與SEC前端相連接，檢測(cè)了單克隆抗體IgG樣品的分子量和分子量分布信息。
原理和設(shè)備
前端凝膠色譜中使用了市場(chǎng)中某主流品牌SEC，具有RI檢測(cè)器，使用TSK氧化硅柱進(jìn)行分離。
采用丹東百特公司的BeNano 180 Zeta Max納米粒度及Zeta電位分析儀進(jìn)行測(cè)試，儀器使用波長(zhǎng)671nm，功率50mW激光器作為光源，在90°進(jìn)行光散射信號(hào)收集。測(cè)試使用了27μL低容量流通池作為檢測(cè)池。利用BFC-1信號(hào)采集器收集前端SEC設(shè)備的示差折光檢測(cè)器輸出的模擬信號(hào)。
樣品制備和測(cè)試條件
將2mg/mL的IgG分散在pH=7的PBS緩沖液中，配置濃度為5mg/mL。進(jìn)樣量100μL，流速為0.7mL/min。
通過(guò)前端SEC進(jìn)行進(jìn)樣，分離。分離后的樣品組分逐一進(jìn)入RI檢測(cè)器和BeNano進(jìn)行信號(hào)收集。BeNano溫度控制在25℃，基本與室溫一致。
測(cè)試結(jié)果和討論
圖1. IgG色譜流出曲線
圖2. IgG分子量流出曲線
圖1中可以看出，IgG經(jīng)過(guò)色譜柱分離得到若干個(gè)流出峰，說(shuō)明IgG在PBS中形成一系列團(tuán)聚狀態(tài)。對(duì)于RI和光散射信號(hào)進(jìn)行基線設(shè)定和積分線設(shè)定，得到每一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的分子量，得到的分子量列于表1中。
圖2為對(duì)于整體信號(hào)積分得到整體分子量流出曲線。通過(guò)分子量隨流出體積曲線可以看出，分子量隨著流出體積逐漸降低，這符合凝膠色譜的分離原理。在每一個(gè)峰內(nèi)，分子量均形成平臺(tái)，這符合蛋白質(zhì)每個(gè)峰內(nèi)某種寡聚狀態(tài)的分子量都分布極窄的特征。
表1. IgG峰內(nèi)分子量Mw結(jié)果
通過(guò)表1每個(gè)峰的分子量可以看出，峰1（最后的流出峰）的分子量為150K，這與IgG的理論分子量一致，峰2-3的分子量均為峰1的倍數(shù)，說(shuō)明峰2-3分別為二聚體和三聚體。從含量中可以看出，單體含量75.8%占大部分含量，但是其他團(tuán)聚成分的含量總和超過(guò)了5%，若此種單抗藥物為注射使用應(yīng)當(dāng)特別注意其可能產(chǎn)生的免疫原性的副作用。
結(jié)論
在該應(yīng)用報(bào)告中，利用BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式檢測(cè)了IgG樣品的分子量信息，通過(guò)結(jié)果可以看出，BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式可以分別準(zhǔn)確地得到一系列IgG樣品流出峰的分子量，通過(guò)分子量值可以準(zhǔn)確判斷出各個(gè)流出峰對(duì)應(yīng)的團(tuán)聚狀態(tài)。
生物類(lèi)藥品中的團(tuán)聚物的存在會(huì)影響其療效和用藥風(fēng)險(xiǎn)，大的團(tuán)聚物會(huì)引起人體免疫源性的反應(yīng)，因此對(duì)于單抗類(lèi)藥物中團(tuán)聚物的種類(lèi)和含量的識(shí)別非常重要。BenNano靜態(tài)流動(dòng)模式對(duì)于單抗的檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)靜態(tài)光散射流動(dòng)模式可以清晰地分辨出單抗的團(tuán)聚物種類(lèi)并計(jì)算出其有效含量。這對(duì)于生物藥研發(fā)具有重要意義。
